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紫外可見分光光度計法測定核酸核苷酸的原理

核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健 系統(tǒng)（－C＝C 一C＝C 一），能夠強烈吸收250~280nm 波長的紫外光。核 酸（DNA，RNA）的zui大紫外吸收值在260nm 處。遵照Lambert-Beer 定律， 可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質(zhì)的含量。在不同pH 溶液中嘌呤、 嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異，它們 的摩爾消光系數(shù)也隨之不同。所以，在測定核酸物質(zhì)時均應(yīng)在固定的pH 溶 液中進行。
核酸的摩爾消光系數(shù)（或吸收系數(shù)），通常以ε（ρ）來表示，即每升含 有一摩爾核酸磷的溶液在260nm 波長處的消光值（即光密度，或稱為光吸 收）。核酸的摩爾消光系數(shù)不是一個常數(shù)，而是依賴于材料的前處理、溶液 的pH 和離子強度發(fā)生變化。它們的經(jīng)典數(shù)值（pH = 7.0）如下：
DNA 的ε（ρ）= 6 000 － 8 000
RNA 的ε（ρ）= 7 000 －10 000
含1μg /mL RNA 溶液的光密度為0.022~0.024。采用紫外分光光度法測 定核酸含量時，通常規(guī)定：在260nm 波長下，濃度為1μg/mL 的DNA 溶液 其光密度為0.020，而濃度為1μg/mL 的RNA 溶液其光密度為0.024。因此， 測定未知濃度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可計算測出其中 核酸的含量。
該法簡單、快速、靈敏度高，如核酸3μg／mL 的含量即可測出。對于 含有微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)的核酸樣品，測定誤差較小，若 樣品內(nèi)混雜有大量的上述吸收紫外光物質(zhì)，測定誤差較大，應(yīng)設(shè)法事先除去。
三、器材
1、分析天平；2、離心機； 3、容量瓶；4、紫外分光光度計；5、吸管
6、冰浴或冰箱
四、試劑
1、5%~6%氨水
2、鉬酸銨-高氯酸試劑（沉淀劑）。如配制200mL 可在193mL 蒸餾水中加
入7mL70%高氯酸和0.5g 鉬酸銨。
五、操作
1、用分析天平準(zhǔn)確稱取待測的核酸樣品500 mg，加少量蒸餾水調(diào)成 糊狀，再加入少量的水稀釋。然后用5%~6%氨水調(diào)至pH7，定容到50mL。
2、取2 支離心管，向*支管內(nèi)加入2mL 樣品溶液和2mL 蒸餾水； 向第二支管內(nèi)加入2mL 樣品溶液和2mL 沉淀劑，以除去大分子核酸作為對照。 混勻。在冰浴或冰箱中放置30 分鐘后離心（3000r/min，10 分鐘）。從* 管和第二管中分別吸取0.5mL 上清液，用蒸餾水定容到50mL。用光程為1cm 的石英比色杯，于260nm 波長處測其光吸收值（A1 和A2）。
六、計算
如果已知待測的核酸樣品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸， 即可將樣品配制成一定濃度的溶液（20~50kg/mL）在紫外分光光度計上直接 測定。